1. Parameter aus Blut, Serum, Plasma und Co

1.1. Einleitung

Die Bestimmung der meisten im Labor angeforderten Parameter erfolgt aus venösem Blut. Je nach Parameter, muss das Blut zuvor komplett durchgerinnen oder an der Gerinnung gehindert werden.

Den von den Gerinnungsfaktoren befreiten, flüssigen Anteil des Blutes, der entsteht, wenn durchgeronnenes Blut abzentrifugiert wird, bezeichnet man als Serum. Wird das frische Vollblut durch Zusatz verschiedener Substanzen an der Gerinnung gehindert, entsteht kein Koagel, die Zellen bleiben einzeln im Plasma, wie der flüssige Anteil des Blutes bezeichnet wird, der noch alle Gerinnungsfaktoren enthält. Je nach Zusatz wird das Plasma dann als EDTA-, Citrat-, NaF- oder Heparinplasma bezeichnet.

Das Verweilen des Serums oder des Plasmas über dem Blutkuchen bzw. den zellulären Bestandteilen des Blutes führt bei der Messung bestimmter Parameter zu falschen Ergebnissen. Deshalb muss das Plasma oder das Serum in diesen Fällen von den zellulären Bestandteilen getrennt werden.

Muss dies außerhalb des Labors geschehen, gibt es dafür sog. Gel-Monovetten. Das darin enthaltene Gel liegt in der Dichte zwischen den zellulären Bestandteilen und dem Serum/Plasma. Es legt sich bei der Zentrifugation als absolut dichte Trennschicht über die Zellen. Ein Abpipettieren kann somit entfallen. Muss das Serum bzw. das Plasma tiefgefroren werden, kann dies in der Gel-Monovette erfolgen. Bitte beachten Sie, dass das Gel seine Wirkung erst nach der Zentrifugation entfaltet. Das Zentrifugieren muss daher rasch nach dem Durchgerinnen (Serum) bzw. sofort nach der Abnahme (Plasma) erfolgen.

Zur Bestimmung von Laborparametern, für deren Bestimmung die Trennung des Serums oder Plasmas von den zellulären Bestandteilen unbedingt notwendig ist, folgen hier einige allgemeine Vorbemerkungen, die den Hintergrund des danach beschriebenen präanalytischen Aufwandes für einige Parameter etwas verdeutlichen sollen.

1.1.1. Entnahme des Blutes

Die Blutentnahme sollte mit möglichst dicken Kanülen erfolgen (optimal: 20G, gelb) um eine Hämolyse durch die Scherkräfte, die durch die starke Beschleunigung in der Nadel während der Aspiration (Ziehen am Stempel) auftreten, zu vermeiden.

Bei Medikamenten ist darauf zu achten, ob ein Tal- oder ein Spitzenspiegel verlangt ist. Talspiegel sind direkt vor Gabe zu entnehmen. Der Abstand zwischen Gabe und Blutentnahme für einen Spitzenspiegel hängt von der Pharmakokinetik des Medikamentes ab.

Die Blutentnahme erfolgt, wenn möglich, in der Ellenbeuge. Wenn sich dort keine sicher tastbare Vene findet, sollte das Blut besser am Handrücken entnommen werden, anstatt in der Ellenbeuge „herumzustochern“.  

Zwischen Stauen und Punktion sollte nicht zu viel Zeit vergehen. Sind mehrere Monovetten abzunehmen, sollte das Citratblut nicht als erstes abgenommen werden um keine Luft zu aspirieren – dies gilt besonders bei Verwendung von Butterflies – da hier ein bestimmtes Mischungsverhältnis zwischen entnommenem Blut und vorgelegter Citratlösung einzuhalten ist.

1.1.2. Beschriftung der Proben

1.1.3. Anforderungsscheine

Zu jeder Probe wird ein Anforderungsschein benötigt, der neben dem vollständigen Namen auch das Geburtsdatum und die vollständige Adresse des Patienten sowie der Kostenträger mit allen relevanten Daten enthalten sein. Wurde wenig Material eingesandt und mehrere Parameter angefordert, eine Analysenpriorität z. B. durch Nummerierung der Parameter angegeben werden.

Bitte beachten Sie, dass bei Anforderung humangenetischer Untersuchungen (z. B. Faktor V Mutation Leiden, Pharmakogenetik oder 1. Trimester-Screening) die Vorgaben des Gendiagnostikgesetzes (GenDG, seit 01.02.2010 in Kraft) beachtet werden müssen. So muss z. B. eine gesetzeskonforme Einwilligung des Patienten vorliegen, bevor wir die Untersuchung durchführen dürfen.

1.2. Serum

Aus dem durch Punktion des Patienten gewonnenen Vollblut wird erst durch den Gerinnungsvorgang und anschließendes Zentrifugieren das Serum erzeugt.
Die stabilsten Parameter sind in der Regel Proteine, die keine Enzymfunktion haben, wie z. B. Immunglobuline (als Gesamt-IgG oder spezifisch in der Serologie, IgE usw.) oder Albumin. Sie sind gegen Verweilen auf dem Blutkuchen ziemlich unempfindlich.

Das Entsprechende gilt für viele Ionen und Reste anorganischer Säuren: diese sind innerhalb der Erythrozyten und außerhalb im Serum oder Plasma in etwa der gleichen Konzentration vorhanden. Andere Parameter, wie z. B. Kalium oder Phosphat sind in Erythrozyten deutlich höher konzentriert als im Serum und werden durch die aufgrund der Hypoxie einsetzende Hämolyse im Serum falsch hoch gemessen.

Um verlässliche Werte zu ermitteln, reicht es aus, das Serum entweder durch Überführen in ein neutrales Röhrchen oder die Verwendung einer Gel-Monovette von den Zellen zu trennen.

Für Enzyme und Hormone ist die Stabilität im Plasma bzw. Serum stark von der Funktion im Körper abhängig. Viele Hormone wie z. B. Cortisol, FSH oder Östradiol sind sehr lange stabil.

Als Beispiel für ein sehr instabiles Hormon sei hier Insulin beschrieben. Dieses Hormon muss in vivo nach einer kohlenhydratreichen Mahlzeit den Blutzuckerspiegel rasch normalisieren, diese Funktion aber zeitlich stark begrenzt ausüben, sonst wäre eine ausgeprägte Hypoglykämie die Folge. In vivo gibt es daher im Plasma Enzyme, die Insulin rasch abbauen. Die Halbwertszeit des Insulins liegt in vivo unter 10 Minuten.

Werden die angeforderten Parameter wie z. B. Insulin von nicht-Calcium-abhängigen Enzymen abgebaut, muss das Serum sofort nach dem Durchgerinnen abzentrifugiert, vom Blutkuchen getrennt und tiefgefroren werden. Werden Gel-Monovetten verwendet können diese nach der Zentrifugation ohne Abkippen tiefgefroren werden.

1.2.1. Zentrifugation von Serum-Gel-Monovetten

Das hier für Serum-Gel-Monovetten beschriebene Vorgehen gilt auch für EDTA- oder Li-Heparin-Gel-Monovetten. Lediglich die abweichende RZB (relative Zentrifugalbeschleunigung, s. Abb. 3) muss berücksichtigt werden.

Die 3 Abbildungen können durch anklicken vergrößert werden.

Abb. 2: Lagerung von Gel-Monovetten direkt nach der Blutentnahme	Optimalerweise sollten die Serum-Gel-Monovetten die ersten 15 Minuten nach der Blutentnahme stehend gelagert werden, da es sonst zu einer sog. "Wurstbildung" kommt, die während der Zentrifugation die Ausbildung der Gelschicht - besonders bei starren Rotoren - behindert.
Abb.‍3: Zentrifugationsempfehlung für verschiedene Monovetten	Serum Gel-Monovetten werden 10 Minuten bei 2.500 g zentrifugiert. Die Drehzahl hängt vom Radius der Zentrifuge ab. Wenn r der Radius in cm und n die Umdrehungen/min sind, gilt für die Relative Zentrifugalbeschleunigung RZB in g (DIN 58970-2) folgende Gleichung: RZB [g] = 0,00001118 × r × n 2 So werden z. B. bei einer Labofuge 200 von Heraeus (Radius 9,65 cm) 2.500 g etwa mit einer Drehzahl von 5.000/min erreicht. Auf der Internetseite der Firma Sarstedt finden Sie einen Rechner, mit dem Sie die notwendige Drehzahl Ihrer Zentrifuge ermitteln können.
Abb. 4: Korrekt ausgebildete Gelschicht einer Gel-Monovette	Nach der Zentrifugation sollte die Gelschicht über dem ganzen Blutkuchen liegen und keine Verbindung mehr zwischen Blutkuchen und Serum bestehen. Dies ist bei Ausschwing-Rotoren immer gewährleistet. Bei starren Rotoren sollte das Ergebnis wie auf der nebenstehenden Abbildung aussehen.Bestehen Zweifel ob die Gelschicht den Blutkuchen sicher vom Serum trennt, das Serum bitte nach der Zentrifugation in ein Neutralröhrchen abkippen.

1.2.2. Gefrorener Versand von Serum

Hierzu siehe bitte Kapitel 1.6.2. Gefrorener Versand

1.3. EDTA-Plasma

Viele Parameter, wie z. B. ACTH oder PTH, werden von Calcium-abhängigen Enzymen abgebaut. Da EDTA Calcium komplexiert und somit den Enzymen entzieht, ist der Abbau vieler empfindlicher Parameter in EDTA-Blut vermindert, man gewinnt daher gegenüber dem Serum etwas zeitlichen Spielraum. Um die Enzymaktivität zum Stillstand zu bringen, wird anschließend noch abzentrifugiert und das Plasma tiefgefroren. Die Trennung von den zellulären Bestandteilen ist notwendig, da beim Tieffrieren die Erythrozyten zur kompletten Hämolyse gebracht würden. Somit würden alle Enzyme aus Erythrozyten frei werden und könnten ihrerseits wiederum die Bestimmung stören oder den Parameter abbauen.

Alle Parameter, bei denen im Untersuchungsprogramm nur EDTA-Plasma als Material angegeben ist, sind i. d. R. sehr empfindlich und müssen unbedingt:

1. in einer EDTA-Gel-Monovette abgenommen werden,
2. nach der Abnahme sofort abzentrifugiert werden
3. und können bei Verwendung einer EDTA-Gel-Monovette in der Abnahme-Monovette tiefgefroren werden. Ansonsten muss das Plasma zuvor noch in ein neutrales Röhrchen pipettiert werden.

Da das EDTA als Kalium-EDTA (K-EDTA) zugesetzt wird, ist eine Kaliumbestimmung aus EDTA-Plasma nicht möglich. Ebenso ist die Aktvitätsbestimmung von Enzymen, die ihrerseits Calcium-abgängig sind, aus EDTA-Plasma nicht möglich.

Werden in den Testreagenzien 2-wertige Kationen verwendet, die auch von EDTA komplexiert werden, kann ebenfalls keine Bestimmung aus EDTA-Plasma erfolgen.

1.3.1. Hinweise zur Gewinnung von EDTA-Plasma

Hierzu siehe bitte Kapitel 1.6.1. Hinweise zur Gewinnung von Citrat- oder EDTA-Plasma.

1.3.2. Hinweise zum gefrorenen Versand EDTA-Plasma

Hierzu siehe bitte Kapitel 1.6.2. Gefrorener Versand von Plasma Serum und anderen Materialien.

1.4. EDTA-Blut

Die häufigste Anwendung für EDTA-Blut ist die Beurteilung der Zellen des Blutes. EDTA-Blut wird benötigt für das herkömmliche Blutbild (maschinell/mikroskopisch) und die weitergehende Durchfluss-zytometrische Analyse der Lymphozyten wie z. B. die Bestimmung der CD4+-T-Helferzellen bei HIV-Infektion. Die Zellen sind in dieser Umgebung nur begrenzt stabil, EDTA-Blut älter als 24 h sollte daher nicht mehr für die Beurteilung der Zellen herangezogen werden. Auch für die Blutgruppenbestimmung und zum Nachweis von Hb-Varianten (z. B. HbA1c oder Hb-Elektrophorese) ist EDTA-Blut notwendig. Zum Nachweis von Punktmutationen (z. B. Faktor V Mutation Leiden oder dem Hämochromatose-Gen C282Y) wird die DNA des Patienten benötigt. Diese ist einfach und sicher aus den Leukozyten im EDTA-Blut zu gewinnen. Die DNA ist in EDTA-Blut über mehrere Tage stabil. Für genetische Untersuchungen ist es wie für die Blutgruppenbestimmung unabdingbar, dass die Monovette mit Namen, Vornamen und Geburtsdatum beschriftet ist. Hierbei sind die Vorgaben des Gendiagnostikgesetzes (GenDG, seit 01.02.2010 in Kraft) zu beachten – so muss z. B. eine gesetzeskonforme Einwilligung des Patienten vorliegen, bevor wir die Untersuchung durchführen dürfen.

Zum Nachweis von Viren in EDTA-Blut sollte eine eigene Monovette verwendet werden, die für keine weiteren Bestimmungen vorgesehen ist. Somit wird eine Kontamination durch Pipettieren, Öffnen u. ä. verhindert. Diese Monovette sollte schnell – möglichst noch am Tag der Blutabnahme – im Labor eintreffen. Wenn EDTA-Blut angefordert ist, sind außer dem Einhalten des zeitlichen Rahmens keine weiteren Dinge zu berücksichtigen. Tieffrieren zerstört die Zellen und macht eine Bestimmung der o. g. Parameter unmöglich!

1.5. Citrat-Blut

Für Citratplasma gilt im Prinzip das gleiche wie für EDTA-Plasma, doch wird es in der Regel nur für Gerinnungsparameter verwendet, da hier das Plasma 1:10 mit der Citratlösung verdünnt wird und der pH-Wert etwas niedriger liegt. Da die Citratlösung in den Monovetten vorgelegt ist, wird das korrekte Mischungsverhältnis nur bei komplett gefüllter Monovette erreicht. Bei Teilfüllung werden alle Parameter pathologisch (s. Abb. 5).

Gerinnungsparameter aus dem Routinelabor (z. B. Quick, PTT oder Fibrinogen) sind einige Stunden in Citratblut stabil und somit bei zeitnahem Transport ins Labor nicht unbedingt zu zentrifugieren, abzupipettieren und tiefzufrieren.

Alle anderen Gerinnungs-Parameter müssen aus Citratplasma bestimmt werden, das sofort nach der Abnahme abzentrifugiert, von den Zellen getrennt und tiefgefroren wurde.

Direkt aus Citratblut wird der Thrombozytenfunktionstest durchgeführt. Wurde das Citratblut zentrifugiert, sind diese beiden Bestimmungen nicht mehr möglich. Bei Anforderung eines Thrombozytenfunktionstestes ist daher eine zusätzliche Citrat-Monovette abzunehmen, wenn gleichzeitig Gerinnungsparameter angefordert werden.

Für die Thrombozytenzählung bei V. a. EDTA-induzierter Pseudothrombozytopenie wurde früher auch Citratblut verwendet. Inzwischen kommt eine spezielle Monovette ("Thromboexakt") zum Einsatz.

Abb. 5: Verlauf der Parameter Quick und PTT bei zu geringer Befüllung der Citratmonovetten (Verdünnung)

Abb. 5: Töpfer et al. Präanalyt. Probleme b. Gerinnungsuntersuchungen im venösen Citratbl., Katheterbl. und Kapillarbl. JLabMed 2000;24:514-20

1.6. Citrat-Plasma

Alle Parameter, bei denen im Untersuchungsprogramm nur Citratplasma als Material angegeben ist, sind sehr empfindlich und müssen ...

sofort nach der Abnahme
1. abzentrifugiert,
2. das Plasma in ein neutrales Röhrchen pipettiert
3. und tiefgefroren

... werden.

Näheres hierzu in Kap. 1.6.1. und 1.6.2.

Da das Citrat als Natrium-Citrat zugesetzt wird, ist hier eine Natriumbestimmung unmöglich. Ebenso wie in EDTA-Plasma ist die Aktvitätsbestimmung von Enzymen, die ihrerseits Calcium-abgängig sind, aus Citrat-Plasma nicht möglich. Außerdem stört die Verdünnung 1:10.

1.6.1. Hinweise zur Gewinnung von Citrat- oder EDTA-Plasma Abb. 6: Korrektes Abpipettieren von Plasma Bezüglich des Vorgehens für EDTA- oder Li-Heparin-Gelmonovetten siehe Kap. 1.2.1. Parameter, die aus Citrat- oder EDTA-Plasma bestimmt werden, sind i. d. R. sehr empfindlich. Das Blut sollte daher direkt nach der Entnahme zentrifugiert werden. Sobald die Zentrifugation beendet ist, muss das Plasma von den Zellen getrennt werden. Da die Zellen im Gegensatz zu durchgeronnenem Vollblut nicht durch Gerinnselbildung verklumpt sind, kann das Plasma nicht einfach in ein neutrales Röhrchen umgekippt werden - es muss vorsichtig abpipettiert werden. Versehentlich aus dem Blutentnahmegefäß  in das neutrale Röhrchen überführte Zellen oder Thrombozyten stören die Messung der zu untersuchenden Parameter. Deshalb wird dringend empfohlen, mindestens ein Millimeter der Plasmasäule auf den Zellen zu belassen. So wird verhindert, dass bei der Aspiration die Zellen und Thrombozyten aufgewirbelt werden und in das neutrale Röhrchen gelangen (s. Abb. 6).

1.6.2. Gefrorener Versand von Plasma Serum und anderen Materialien

Das neutrale Röhrchen muss direkt nach der Trennung von den Zellen im Gefrierfach deponiert werden, damit es so schnell wie möglich auf mindestens −20°C abgekühlt wird.

Ist das erreicht, kann das Röhrchen für viele Tage so gelagert werden. So können Proben die freitags entnommen wurden problemlos am Montag dem Fahrer zum Transport auf Trockeneis mitgegeben oder mit dem entsprechenden Versand-System per Post oder Paketdienst versandt werden. Den Ablauf entnehmen Sie bitte dem folgenden Fluss-Diagramm:

Tab 6: Ablauf Versand gefrorener Proben

Tab 6: Ablauf Versand gefrorener Proben

1.7. Natrium-Fluorid-Blut

Eine andere Möglichkeit, Enzymaktivitäten zu unterbinden, ist das Enzymgift Natrium-Fluorid (NaF). Hiermit wird der Stoffwechsel zum Erliegen gebracht und die Konzentration diverser Substrate wie Glucose oder Metaboliten wie Lactat oder Pyruvat nicht weiter verändert.

Wenn die Bestimmung der Glucose aus Serum erfolgt, das sich länger über dem Blutkuchen befand, sind die gemessenen Werte falsch niedrig, da der Blutzuckerspiegel in Vollblut um 90%/24 h abnimmt. Glucose sollte daher immer aus NaF-Blut bestimmt werden.

1.8. Lithium-Heparin-Blut

Dieses Material wird für Untersuchungen der Zellfunktionen von Leukozyten sowie für die Bestimmung der osmotischen Resistenz der Erythrozyten benötigt. Das Heparinblut muss spätestens 24 h nach Abnahme im Labor eintreffen. Die Zellfunktionsteste werden an jedem Werktag durchgeführt. Am Freitag muss das Heparinblut für eine Bearbeitung spätestens um 14 Uhr im Labor eintreffen, am Wochenende können die Proben nicht bearbeitet werden. Der Transport erfolgt bei Raumtemperatur.

Wegen der Pufferung des pH-Wertes bitte nur kommerzielle Abnahmeröhrchen verwenden. Die Proben dürfen nicht abzentrifugiert werden. Bitte beachten Sie, dass aus heparinisiertem Blut keine PCR-Diagnostik möglich ist.