3. Bakteriologie (kultureller Erregernachweis)

3.1 Einleitung

Für bakteriologische oder parasitologische Untersuchungen bitte getrennte Proben in separaten Entnahmegefäßen einsenden.

Die präanalytischen Anforderungen für Proben, die dem kulturellen Erregernachweis dienen, werden im Folgenden für die einzelnen Materialen erläutert.

Bezüglich Lagerung und Transport bakteriologischer Proben gelten folgende Temperaturvorgaben:

3.2. Blutkulturen

Blutkulturen dienen dem kulturellen Nachweis von Bakterien/Pilzen im Blut bei V. a. Bakteriämie/Fungämie im Rahmen generalisierter bakterieller Infektionen bzw. bei Sepsis (Ausnahme: Mykobakterien sind nicht in Blutkultur-Flaschen kultivierbar).

Blutentnahme: Die Punktion erfolgt nach sorgfältiger Desinfektion der Punktionsstelle (Einwirkzeit beachten: bei alkoholischen Desinfektionsmitteln 1 min) bevorzugt peripher venös in Blutkultur-Flaschen. Eine Entnahme aus dem ZVK sollte nur im Ausnahmefall durchgeführt werden, um unnötige Kontaminationen der Blutkulturen zu vermeiden.

Bei V. a. eine systemische Candida-Infektion ist die Untersuchung von Nativurin auf Pilze indiziert, da diese im Rahmen der Fungämie z. T. auch über die Harnwege ausgeschieden werden.

3.2.1. Abnahme, Lagerung und Transport

Die Lagerung und der Versand der Blutkultur-Flaschen BACTEC® erfolgt bei Raumtemperatur. Eine Vorinkubation im Brutschrank darf nicht durchgeführt werden. Auf dem Begleitschein: muss unbedingt Entnahmezeitpunkt und -ort vermerkt werden, um eine spätere Zuordnung zu ermöglichen.

Blutkulturen werden generell 5 Tage bebrütet. Bei V. a. Endokarditis wird die Kulturdauer auf 21 Tage verlängert, um auch langsam wachsende Erreger nachzuweisen. Bei relevanten positiven Blutkulturen erfolgt eine telefonische Mitteilung durch den Mikrobiologen (an Sonn- und Feiertagen gegen 12:00 Uhr).

3.2.2. Beimpfung mit Punktaten

Blutkultur-Flaschen (BACTEC®) können auch mit Punktaten beimpft werden (z. B. Liquor, Pleura-, Gelenk- oder Aszitespunktat). Auch hier erfolgt die Lagerung bis zur Abholung bei Raumtemperatur.

Wenn eine mikroskopische Beurteilung des Punktates erforderlich bzw. erwünscht ist, zusätzlich einen Teil des Punktates in ein steriles Röhrchen mit Schraubverschluss geben und bei Raumtemperatur lagern/transportieren. Für klinisch-chemische Diagnostik (z. B. Zellzahl) zusätzlich noch ein Punktat in EDTA einsenden (s. Kap. 2.2.). Für weitere Hinweise zum kulturellen Erregernachweis aus Punktaten siehe auch Kap. 3.4.

3.3. Liquor cerebrospinalis

Bei V. a. bakterielle Meningitis ist der bakteriologische Nachweis der ursächlichen Erreger essentiell. Bitte beachten Sie, dass in diesem Fall immer auch Blutkulturen angelegt werden. Bezüglich der klinisch-chemischen Parameter in der serologischen Diagnostik siehe Kap. 2.3.

3.3.1. Abnahme, Lagerung & Transport

Wegen der extremen Anfälligkeit mancher Meningitiserreger, insbesondere Meningokokken, gegenüber Umwelteinflüssen (z. B. Abkühlung, Nährstoffmangel) empfiehlt sich folgendes Vorgehen: 

1. Direkt nach der Lumbalpunktion wird die Liquorprobe geteilt.
2. 500-1.000 µl für klinisch-chemische Untersuchung (Eiweiß, Zucker, Zellzahl, Blut-Liquor-Schranke usw. s. auch Kap. 2.3.) asservieren.
3. Ca. 200 µl Liquor für die bakteriologische Mikroskopie sowie ggf. für den Nachweis von Antigenen in steriles Röhrchen mit Schraubverschluss geben und bis zur Abholung gekühlt lagern.
4. Das restliche Material (mindestens 1.000 µl) zum kulturellen Nachweis in aerobe Blutkultur-Flasche verimpfen, diese Flasche nicht belüften (führt zu Kontamination durch Luftkeime) und bis zur Abholung bei Raumtemperatur lagern.
5. Bei V. a. virale Meningitis keine Blutkultur-Flasche beimpfen, sondern das gesamte Material, welches nicht für die klinisch-chemische Untersuchung benötigt wird, in ein steriles Röhrchen mit Schraubverschluss geben.

3.4. Punktate (Pleura-Flüssigkeit, Aszites, Gelenkerguss, Abszess-Aspirat)

Wenn irgend möglich sollten 10-20 ml des Punktates in einem sterilen Schraubröhrchen asserviert werden (siehe auch Punkt 3). Im Labor kann dann bei dünnflüssigen Materialien durch Zentrifugieren eine Anreicherung der häufig nur in geringer Zahl vorhandenen Erreger erreicht werden.

Das häufig gepflegte Vorgehen, einen Abstrichtupfer mit dem Punktat zu benetzen, diesen einzusenden und den Rest des Punktates zu verwerfen, führt zu einer unnötig niedrigen Nachweisrate.

Abszess-Punktate können auch in der Punktionsspritze mit fest aufgesetztem sterilen Konus verschickt werden (ohne Nadel!).

Vorgehen bei der Entnahme von Gelenkpunktaten

1. Erst punktieren, dann therapieren
   
   
Grund: Bereits 1 Dosis vor Punktion kann dazu führen, dass sich die Erreger nicht mehr anzüchten lassen.


2. Alkoholisches Desinfektionsmittel vor Punktion verdunsten lassen
   
   
Grund: Desinfektionsmittelreste, die bei Punktion in die Probe gelangen, können die Anzucht beeinträchtigen; wird die Desinfektion mit Jod durchgeführt, muss dieses vor Punktion mit Alkohol abgewischt werden (remanente Wirkung von Jod).


3. Wenn die Probe innerhalb von 3 h im Labor eintrifft (Abholzeiten beachten!) und dort weiter bearbeitet wird, kann die Punktatflüssigkeit (5-10 ml) nativ in einem sterilen Röhrchen mit Schraubverschluss transportiert werden. Andernfalls wie folgt vorgehen:
5-10 ml Punktat in eine anaerobe Blutkultur-Flasche spritzen (Gummistopfen vorher mit Alkohol besprühen und trocknen lassen); bei größeren Punktatvolumina 2 Flaschen (anaerob/aerob) beimpfen.

Grund: Das Blutkulturmedium bietet für die in Frage kommenden Erreger optimale Wachstumsbedingungen; zudem kann bei geringer Erregerdichte durch das größere Probenvolumen eine höhere Ausbeute erzielt werden.


4. Nativmaterial und Blutkultur-Flaschen bei Raumtemperatur lagern und transportieren
   
   
5. NICHT vorbebrüten
   
   
6. Blutkultur-Flaschen müssen spätestens 48 h nach Beimpfung im Labor in den Spezialbrutschrank. Die Lagerung und der Transport von Punktaten erfolgt bei Raumtemperatur.

3.5. Urin

Urinkulturen werden bei V. a. Harnwegsinfektion durchgeführt. Bei der Passage des Urins durch die Harnröhre kommt es auch bei Mittelstrahl-Urin häufig zur Kontamination durch Harnröhrenflora. Deshalb wird im Labor eine quantitative Bestimmung durchgeführt.

Wird der Urin durch Blasenpunktion oder Einmal-Katheterisierung gewonnen, muss dies unbedingt auf dem Begleitschein vermerkt werden: In diesen Fällen gelten für die quantitative Beurteilung andere Kriterien als bei Mittelstrahl-Urin oder bei Urin, welcher aus einem Dauerkatheter entnommen wurde.

Bei Patienten mit Dauerkatheter darf die Urinprobe auf keinen Fall aus dem Sammelbehälter entnommen werden! Die Punktion muss nach vorausgegangener Desinfektion des dafür vorgesehenen Gummistopfens im Katheter erfolgen.

3.5.1. Abnahme, Lagerung und Transport

Urinproben werden generell gekühlt gelagert und transportiert.

3.5.2. Chlamydien- und Neisserien-Nachweis

Die Diagnostik erfolgt mittels eines Nukleinsäure-Amplifikationsverfahrens. Hierzu wird ein spezielles Abnahmebesteck Aptima® der Firma Hologic / Gen-Probe benötigt. Im Folgenden finden Sie die Anleitung zur Gewinnung von Urinproben.
Die Patienten sollten vor der Probengewinnung mindestens 1 Stunde lang nicht uriniert haben. 

1. Die Patientin/den Patienten bitten, etwa 20 ml bis 30 ml Erststrahlurin in einem Urinsammelbecher aufzufangen. Das Auffangen größerer Urinmengen könnte zu einer Verringerung der Testempfindlichkeit führen. Patientinnen dürfen den Schamlippenbereich vor der Abgabe der Urinprobe nicht reinigen.
2. Das gelbe APTIMA® Probentransportröhrchen mit Name, Vorname und Geburtsdatum der Patientin/des Patienten beschriften. Den Schraubdeckel abschrauben und mit der beiliegenden Einwegpipette ca. 2 ml Urin aus dem Sammelbecher in das Probentransportröhrchen überführen (s. unten). Das zugegebene Urinvolumen ist korrekt, wenn sich der Flüssigkeitspegel zwischen den schwarzen Befüllungslinien auf dem Etikett des Probentransportröhrchens befindet (s. unten).
3. Das gelbe Probentransportröhrchen nun wieder gut verschließen.

Das beschriftete und mit Urin befüllte APTIMA Probentransportröhrchen bei 2 °C bis 30 °C verschicken oder bei dieser Temperatur bis zur Verschickung lagern. Die Proben müssen jedoch nach Entnahme innerhalb von 30 Tagen getestet werden. Ist eine längere Lagerung, bis maximal 90 Tage, erforderlich, müssen die Proben nach der Entnahme bei –20 °C bis –70 °C eingefroren werden.

Abb. 7: Gewinnung einer Urinprobe mit dem System Aptima®

3.6. Sekrete aus dem Respirationstrakt: Sputum, Trachealsekret, Bronchial-Lavage (BAL)

Die bakteriologische Untersuchung von Respirationstraktsekreten ist generell nur dann sinnvoll, wenn die Patienten nicht antibiotisch anbehandelt sind. Unter Antibiotika-Therapie können viele Erreger auf den im Labor verwendeten Nährmedien nicht mehr angezüchtet werden, obwohl sie im Patienten u. U. noch vermehrungsfähig sind. Deshalb sollten die Proben möglichst vor Therapie, nach Antibiotika-Pause oder zumindest am Ende eines Antibiotika-Intervalls d. h. direkt vor der nächsten Infusion oder Antibiotika-Gabe abgenommen werden.

Patienten mit Auswurf werden angehalten, vorher eine Mundspülung mit Leitungswasser - auf keinen Fall desinfizierendes Mundwasser - durchzuführen, um die Zahl der Kontaminanten aus der Mundhöhle zu reduzieren.

Soll das Sputum auf Mykobakterien untersucht werden, muss die Spülung mit Leitungswasser entfallen, da Leitungswasser Umwelt-Mykobakterien enthalten kann, welche das Ergebnis der Diagnostik verfälschen können!

Wie bei Urin sollten die Lagerung und der Transport immer gekühlt erfolgen, um ein Überwuchern durch Standortflora des oberen Respirationstraktes zu vermeiden.

Das Material wird nativ in den dafür vorgesehenen Sputum-Behältern oder einem 100ml Becher eingesandt. Soll die Probe auf Chlamydophila pneumoniae oder auf Mycoplasma pneumoniae untersucht werden, wird ebenso verfahren (der Nachweis erfolgt jedoch mit molekularbiologischen Verfahren). Bei Verdacht auf Legionellose muss zusätzlich ca. 5 ml Nativurin in sterilem Schraubröhrchen eingesendet werden (Anforderung: Nachweis von Legionella-Antigen).

3.7. Abstriche

Wundabstriche müssen immer in ein bakteriologisches Transportröhrchen mit Gel gegeben werden (z. B. Transystem®), um ein Absterben der Erreger durch Austrocknen oder Nährstoffmangel zu vermeiden. Die gebräuchlichen Transportröhrchen enthalten ein farbloses oder schwarzes (Aktivkohle) Gel, in welches der Tupfer eingebracht wird.
Die Lagerung und der Transport von Wundabstrichen erfolgt bei Raumtemperatur.

3.7.1. Chlamydien- und Neisserien-Nachweis

Das bisher zur Bestimmung der Chlamydien  verwendete spezielle Transportmedium mit violetter Kappe darf nicht mehr verwendet werden!
Die Diagnostik erfolgt mittels eines Nukleinsäure-Amplifikationsverfahrens. Hierzu wird ein spezielles Abnahmebesteck Aptima® der Firma Gen-Probe benötigt. Im Folgenden finden Sie die Anleitung zur Gewinnung endozervikaler Abstrichproben:

1. Schleimreste vom Muttermund und der umliegenden Schleimhaut mit dem Reinigungstupfer (Tupfer mit weißem Schaft in der Packung mit rotem Aufdruck) entfernen. Diesen Tupfer dann verwerfen!! (s. unten)
2. Ein APTIMA Probentransportröhrchen (lila Aufdruck) mit Name, Vorname und Geburtsdatum der Patientin beschriften.
3. Den Probensammler (mit blauem Schaft in der Packung mit grünem Aufdruck) in den Endozervikalkanal – bei männlichen Patienten entsprechend in die Harnröhre – einführen (s. unten).
4. Den Probensammler im endozervikalen Kanal respektive der Harnröhre 10 bis 30 Sekunden lang vorsichtig im Uhrzeigersinn drehen, um die Entnahme einer ausreichenden Probenmenge zu gewährleisten.
5. Den Schraubdeckel vom Probentransportröhrchen abschrauben und den Probensammler sofort in das Probentransportröhrchen geben.
6. Den Schaft des Probensammlers vorsichtig an der Einkerbung abbrechen; darauf achten, den Inhalt nicht zu verspritzen (s. unten).
7. Das Probentransportröhrchen nun wieder gut verschließen.

Abb. 8: Durchführung eines Genitalabstriches mit dem System von Aptima®

Für den Nachweis von C. pneumoniae aus dem Respirationstrakt s. Kap. 3.6.

3.8. Stuhl

Für einen Erregernachweis aus Stuhl sollte mit dem Löffelchen aus dem Probengefäß (Stuhlröhrchen) eine ca. erbs- bis kirschgroße Portion entnommen und in das Probengefäß gegeben werden. Bei flüssigem Stuhl ca. 1 ml mit einer Spritze aufnehmen und in ein Stuhlröhrchen geben. Das Röhrchen fest verschließen und in eine Transportverpackung geben (niemals Stuhlprobe direkt in Transportverpackung geben, da diese nicht steril ist und u. U. bakterizide Substanzen abgibt). Die Beschriftung erfolgt auf dem Röhrchen, nicht auf der Transportverpackung!

Bei Diarrhoe nach antibiotischer Vorbehandlung oder nach Auslandsaufenthalt unbedingt entsprechenden Vermerk auf dem Auftragsschein machen, da in diesen Fällen spezielle Verfahren bzw. Nährmedien verwendet werden müssen.

Die Lagerung und der Transport erfolgt gekühlt. Dies verhindert die Überwucherung der enteropathogenen Erreger durch die physiologische Stuhlflora.
Bezüglich der klinisch-chemischen Parameter und der serologischen Diagnostik siehe Kap. 2.4.

3.8.1. Nachweis von Madenwürmern (Oxyuren)

Das Weibchen des Madenwurms wandert in der Nacht zur Eiablage zum Anus. Diese Eier können im Klebefilm-Präparat von der Analhaut lichtmikroskopisch nachgewiesen werden.

Bitte unbedingt beachten:
Probenahme morgens direkt nach dem Aufstehen und vor dem Waschen des Perianalbereichs, da ansonsten die Eier abgespült werden.

3.9. Helicobacter pylori-Kultur aus Magenbiopsien

H. pylori ist extrem empfindlich gegenüber Umwelteinflüssen (vor allem Exposition gegenüber Luftsauerstoff, Nährstoffmangel, Austrocknung). Der kulturelle Nachweis gelingt nur dann zuverlässig, wenn folgende Vorgaben eingehalten werden:

3.10. Spermaproben

Bei Entzündungen von Prostata und Samenwegen kann die bakteriologische Untersuchung einer Spermaprobe angezeigt sein. Spermaproben werden häufig durch Keime aus der Harnröhre massiv verunreinigt und sind dann nicht mehr beurteilbar. Gelegentlich sind in Folge einer antibiotischen Vorbehandlung noch antibakteriell wirksame Substanzen vorhanden, die ebenfalls das Ergebnis verfälschen können.

Einen aussagekräftigen Befund kann das mikrobiologische Labor deshalb nur dann erstellen, wenn einige Regeln bei der Probengewinnung eingehalten werden:

Für Spermatogramme (Fertilitätsdiagnostik nach WHO-Kriterien) gelten andere Vorgaben. Das Sperma muss hierfür nach vorheriger Terminvereinbarung in den Räumen des Labor Enders gewonnen werden (bitte vorab unter 0711 6357-0 informieren).

3.11. Diagnostik bei V. a. Dermatomykosen

Entscheidend für die Qualität des mykologischen Befundes ist die korrekt durchgeführte Materialgewinnung. Bei Verdacht auf Haut-, Haar- oder Nagelmykosen senden Sie bitte das nach den Vorgaben von Tab. 11 gewonnene Material ein.

Die Proben werden in ein neutrales, steriles Schraubröhrchen ohne weitere Zusätze gegeben. Die Proben sollten innerhalb von 2 Tagen im Labor sein, da viele Pilzarten empfindlich gegenüber Austrocknung und Nährstoffmangel sind.

.