4. Virologie (Erregernachweis)

Für virologische ebenso wie für bakteriologische oder parasitologische Untersuchungen bitte getrennte Proben in separaten Entnahmegefäßen einsenden.

4.1. Allgemeine Regeln

Für den direkten Virusnachweis werden folgende Methoden eingesetzt:

•	Isolierung auf Zellkulturen
•	Antigen-ELISA
•	molekularbiologische Methoden (z. B. PCR)

 

Bitte beachten Sie folgende wichtige Hinweise:

 

•	Da in der Zellkultur nur vermehrungsfähige Viren nachgewiesen werden und viele Viren außerhalb des Wirtes ihre Aktivität schnell verlieren, spielt hier die richtige Probenentnahme sowie Lagerung und Transport eine wichtige Rolle.
•	Die Probenentnahme ist in der Regel nur in der akuten Erkrankungsphase sinnvoll, d. h. innerhalb der ersten 3−4 Tage nach Symptombeginn.
•	Nach der Entnahme muss das Material so schnell wie möglich im Labor eintreffen. Bis zum Versand sollten die Proben bei +4 °C gelagert werden.
•	Die Proben dürfen bis zu 48 h bei Raumtemperatur transportiert werden. Im Sommer sollte der Transport gekühlt - nicht gefroren - erfolgen!
•	Wenn der Versand innerhalb von 72 h nicht möglich ist, müssen die Proben bei −70 °C eingefroren und gelagert werden. Proben niemals nur bei −20 °C! einfrieren! Der Versand erfolgt auf Trockeneis.
•	Die PCR ist eine sehr sensitive Reaktion. Um Kontaminationen, d. h. falsch-positive Ergebnisse, zu vermeiden, sollten Proben unter Gebrauch von frischen Einmalhandschuhen entnommen und in separate Probengefäße eingebracht werden. Das Wiederöffnen der Gefäße und Umfüllen ist strikt zu vermeiden.
•	Austrocknen der Proben vermeiden: Bei Austrocknungsgefahr sollte das Virus-Transportmedium (rote Flüssigkeit in Röhrchen mit grüner Kappe ) verwendet werden. Nur im Notfall, wenn ein Virustransportmedium nicht vorhanden ist, kann physiologische Kochsalzlösung verwendet werden.

4.2. Probenentnahme und Transportbehälter

4.2.1. Blutproben

Für die PCR eignet sich insbesondere EDTA-Blut. Der Gebrauch von Heparinröhrchen soll vermieden werden. Heparin hemmt die PCR-Reaktion! Auch für den direkten CMV-pp65-Antigennachweis werden EDTA-Blutproben benötigt (2 ml).

4.2.1.1 Blutproben für die NAT-Testung von Lebendspendern mittels Procleix Ultrio Assay (TMA) für HBV, HCV und HIV 1

	Haltbarkeit der Blutproben für die NAT-Testung in Tagen

In K₂EDTA-, K₃EDTA- oder in Becton-Dickinson EDTA-PPTs (Plasma Preparation Tubes, BD PPT™) gesammeltes Plasma kann verwendet werden. Vollblut, Plasma oder Serum kann bis zu 72 Stunden ab Zeitpunkt der Entnahme bei ≤25°C gelagert werden; Temperaturen von bis zu 30°C sind über maximal 24 Stunden zulässig. Die Proben können weitere 5 Tage bei 2°C bis 8°C im Anschluss an die Zentrifugation gelagert werden. Plasma, von dem die Zellen abgetrennt wurden, kann längere Zeit bei ≤-20°C gelagert werden, bevor es getestet wird. Vollblut nicht einfrieren.

4.2.2. Urinproben

5−10 ml frisch gewonnenen Mittelstrahlurin in Urin-Monovette geben.

4.2.3. Stuhlproben

Für den Virusnachweis wird 1−3 g bzw. 1−3 ml Stuhl, wie für bakteriologische Untersuchungen beschrieben, entnommen und in ein separates Stuhlröhrchen bzw. Stuhl-Monovette eingebracht.

4.2.4. Punktate

Punktate (Pleura-Flüssigkeit, Aszites und Fruchtwasser) werden steril abgenommen und nativ verschickt. Für den Transport kann eine steril "abgestöpselte" Spritze verwendet werden.

Bläscheninhalt mit einer Tuberkulinspritze aspirieren, anschließend in ein Röhrchen mit Virustransportmedium (grüne Kappe) entleeren und die Spritze damit ausspülen.

4.2.5. Abortmaterial, Gewebe und Biopsie

Wenn keine Austrocknungsgefahr besteht, kann das Material nativ an das Labor in einem neutralen sterilen Röhrchen oder Becher geschickt werden. Andernfalls soll Virustransportmedium verwendet werden.

4.2.6. Liquor, flüssige Proben aus dem Respirationstrakt

Liquor und flüssige Materialien (2 ml) aus dem Respirationstrakt (Bronchiallavage, Nasen- und Rachenspülwasser, Nasen- und Rachensekret, Speichel, Sputum) sollen in einem neutralen sterilen Röhrchen verschickt werden.

4.2.7. Abstriche

Für die Abstrichentnahme sollen normale Tupfer aus Baumwolle , Dacron, Rayon oder Nylon-Flockfaser verwendet werden. Keine Calcium-Alginat-Tupfer verwenden! Calcium-Alginat-Tupfer können auf Viren toxisch wirken.

Der Abstrich sollte sofort in ein Röhrchen mit Virustransportmedium eingebracht werden. Der Tupfer wird mit einer Schere so weit gekürzt,, dass der Deckel dicht schließt und der Tupfer im Transportmedium verbleibt. Trockene Abstriche und bakteriologische Abstriche die ein Gel oder Agar-Transportmedium enthalten, sind für den Virusnachweis nicht geeignet!

4.2.7.1. Nasen-, Rachen- und Nasen-Rachen-Abstrich

Zum Nachweis humaner Influenzaviren scheint vor allem ein tiefer Nasen-Rachen-Abstrich - insbesondere bei Kleinkindern - sinnvoll, aber auch ein Rachenabstrich ist möglich.

 

Nasen-Rachen-Abstrich	Den Kopf leicht zurückbeugen und den dünnen Abstrichtupfer aus biegsamem Draht sanft über den Nasenraum in den Nasopharynx einführen. Dabei entsteht ein Hustenreiz! Die "Einführtiefe" sollte etwa der halben Distanz zwischen Nasenflügel und Tragus entsprechen. Den Abstrichtupfer mehrmals rotieren und dann rasch entfernen.
Rachenabstrich	Mit dem Nylon-Flockfasertupfer oder dem Wattestieltupfer wird unter drehenden Bewegungen ein Abstrich von der Rachenschleimhaut entnommen, entweder unter Aufwendung von Druck abgestrichen oder der Tupfer wird beim Abstreichen gedreht (Tonsillen und Rachenhinterwand).

 

4.2.7.2. Genitalabstrich

Bei offenen Ulcera oder Läsionen wird mit dem Nylon-Flockfasertupfer ein Abstrich vom Wundgrund gemacht. Die Materialentnahme soll gezielt unter Vermeidung einer Kontamination durch die Standortflora des umgebenden Gewebes erfolgen.

4.2.7.3. Augenabstrich

Zur Abstrichentnahme ist eine lokale Betäubung der Bindehaut durchaus hilfreich. Dafür sollten möglichst konservierungsfreie Präparate eingesetzt werden, um eine Virusinaktivierung in den Proben zu vermeiden (z. B. Oxybuprocain Augentropfen - Conjuncain® EDO®). Den Tupfer zuerst gut mit steriler physiologischer Kochsalzlösung befeuchten, mehrfach über die Konjunktiva streichen, erst dann in das Virustransportmedium geben (Röhrchen mit der grünen Kappe.

4.2.8. Nachweis Humaner Papillomaviren (HPV) aus zervikalen Abstrichen

Aufgrund der deutlichen Abweichung gegenüber der oben beschriebenen Vorgehensweise wird die Probengewinnung für HPV-Diagnostik im Folgenden gesondert beschrieben.

4.2.8.1 HPV-RNA-Nachweis (Testart TMA)

Zum nicht typspezifischen Nachweis der viralen Onkogene E6 und E7 der 14 wichtigsten High-Risk HPV Typen. Bitte unbedingt das spezielle APTIMA Entnahme und Transportsystem benutzen. Den weißen Tupfer zum Entfernen von exzessivem Mucus und bitte nur die blaue Zytobrush für den Abstrich verwenden. Diese dann im Röhrchen belassen.

4.2.8.2 HPV-Genotypisierung (Testart PCR)

Dient zum typspezifischen HPV-DNA-Nachweis der 24 gängigsten High- und Low-Risk HPV-Typen, einschließlich der in den HPV-Impfstoffen enthaltenen Typen 6, 11, 16 und 18. Der Abstrich erfolgt unter Verwendungunseres Virustransportröhrchens (Grüne Kappe, Aufschrift "Virustransportmedium") mittels normalem Tupfer oder Cytobrush.

4.2.8.3 HPV-Nachweis nicht typspezifisch (Testart HC2)

Dient zum nicht typspezifischen HPV-DNA-Nachweis der Kategorie High-Risk. Für die Abstrichentnahme beachten Sie bitte die jedem Entnahme-Set (DNAPAP Cervical Sampler) beigefügte Anleitung. Der Abstrichträger verbleibt im Röhrchen.

4.2.8.4 Empfohlene Vorgehensweise bei zervikalen HPV-Abstrichen

Die Cytobrush nicht bei schwangeren Frauen verwenden.

 

Die Entnahme des Pap-Abstriches erfolgt vor der Probengewinnung für den HPV-Test. Bei Durchführung einer Kolposkopie ist der HPV-Abstrich vor Applikation von Essigsäure oder Jod zu gewinnen.

1. Exzessiven Mucus mit einem Watte-Tupfer entfernen.
2. Entnahme des (epithelzellhaltigen) Abstrichs.
3. Abstrichträger in das Transportröhrchen verbringen und vermeiden, mit der Außenseite des Röhrchens oder einem anderen Gegenstand in Berührung zu kommen.
4. Den Schaft des Abstrichträgers an der Bruchstelle abbrechen oder abschneiden. Nur der epithelzellhaltige Teil des Abstrichträgers verbleibt im Röhrchen. Das Röhrchen nun gut verschließen.